現在までの研究状況（学振PD）（旧版）

研究の背景と問題点

身体のしびれを伴い、最終的には「ホゲホゲ」と言いながら死に至るホゲホゲ病は、ガン・糖尿病に次いで患者数が多く、日本の成人男性の死亡理由の第１位である。しかし、現時点でホゲホゲ病の根本的な治療方法は存在しない。進行を遅らせるホゲドメ療法には多額の費用がかかるだけでなく、朝晩の座薬が欠かせないため精神的苦痛を伴う。こうしたことから、ホゲホゲ病の根本的な治療方法の確立は喫緊の課題であるが、その原因や発症機構は不明であった。

申請者はこれまでに、ホゲホゲ病の原因遺伝子としてHoge1を同定し、その機能について解析してきた[Tommy et al., 2016]。Hoge1は機能未知の転写因子であり、N末端にDNA結合領域を持っている。さらに、・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・。しかし、hoge1の完全な機能欠損変異体は胚性致死であり、生体におけるHoge1機能の解析は困難であった。さらにHoge1タンパク質は生体内で非常に不安定であるため、転写因子であるHoge1がどのような遺伝子を、どのように制御することでホゲホゲ病の発症に関わっているかついては全く理解が進んでいない。こうしたHoge1機能の理解の遅れが、原因遺伝子が同定されているにも関わらずHoge1を標的とした治療薬が開発されていない主な原因であると考えられた。

研究目的と解決方法

転写因子の標的遺伝子を明らかにするためにはクロマチン免疫沈降（ChIP）解析が有効である。しかし、これまでのChIP解析ではDNAと転写因子の相互作用は恒常的に起こっている必要があり、不安定な転写因子に対してChIP解析をおこなった例は、検出感度の問題から、これまで報告されていなかった。申請者は、近年急速に発展している高感度質量分析法とDNAバーコーディングの手法[xxx et al., 2015, yyy et al., 2016]を組み合わせることによって、瞬間的にしか起きていない転写因子とDNAの相互作用を極めて高感度・低バックグラウンドで検出できるのではないかと考えた。実際、超高感度質量分析を用いることでChIP解析を高感度化した研究例が酵母において報告されつつあり[Sato et al., 2015, James et al., 2016]、ヒト培養細胞を用いた申請者らの予備実験からも、こうした解析が有効であることをすでに確認している（図１）。

これまでの研究経過および得られた結果

（１）高感度質量分析とDNAバーコーディングを組み合わせたGATTAI法の確立

生体内で不安定であるHoge1の転写標的を明らかにするためには、ChIP解析の高感度化およびXXXが必要である。そこで、申請者はこれまでのMS-MS解析の感度をさらに向上させるために、LC-MS-MS-MS解析を開発した。この方法では、通常のMS-MS解析に加えてLC-MS解析を行う。予備的な実験結果では、検出感度が約100倍に上昇しており、理論値の計算から、半減期が約30秒のHoge1タンパク質も十分に検出できることが明らかとなった。

次に、申請者はHoge1とDNAの瞬間的な相互作用を検出するために、DNAバーコーディングの手法を応用することを考えた。Hoge1につけたDNAバーコードを利用し、・・・・・・

・・・・・・・・・することで、・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・が可能となる。このDNAバーコードが実際に機能することを確認するため、転写標的がすでに明らかになっているEgoh1に対してこの手法を適用し、S/N比が約5倍改善された。GATTAI法の基盤要素を確立した。これらの成果はXXXX誌に発表した。

（２）GATTAI法を用いた高感度ChIP解析

これらを組み合わせたGATTAI法をHoge1に適用し、標的候補として約100遺伝子を世界にさきがけて同定した。しかし、得られた遺伝子は予想された数の約1/10であった。YYYによれば、GATTAI法自体はうまくいっていることから、Hoge1はこれまで考えられていたよりも遥かにZZZであり、また、リン酸化されている可能性が初めて示唆された。このことは、これまでのHoge1を対象にしたAAA解析の有効性を見直す必要性を示唆しており、BBBの前処理を行うことでGATTAI法が有効に機能することを明らかにした。

（３）シミュレーションによるAAAの予測

GATTAI法の有効な前処理条件を決定するために、BBBを扱うことのできる新しいシミュレーション手法を開発し、世界で初めてCCCのシミュレーションに成功した。この研究成果は、International Conference of Hoge 2016にて、最優秀ポスター賞を獲得した。

３．研究方法とこれまでの研究経過

（１）エッチング精度の向上と、p側電極金属とpドープ層がオーム性接触となる深さの決定

n側電極金属をAuGeNiからAuGeに変更し、[110]量子井戸へのNiによるダメージを除去した。これにより飛躍的に電流・電圧(I-V)特性を向上させることに成功した。同時に、各工程を最適化し作業時間を三割程度に短縮することに成功した。これらによって試料の作製・評価・再設計のサイクルを早めることが可能になり、本研究を行う上で大きな進歩となった。

（２）新しい試料構造の設計

T型量子細線と隣接する量子井戸とのエネルギー差(ΔE)を大きくするため、各々の量子井戸の厚み・組成を変更した。T型量子細線では、より高温でのレーザー発振を実現するためにはΔEを大きくする必要があった。そこでΔE が約1.5倍の20meVになるように設計した（図1）。また、表面層をGaAsから、よりバンドギャップが大きい30%のAlGaAsへと変更することによって細線へのキャリア注入を可能にした。

研究の特色と独創的な点

申請者は、AAA分野で用いられているBBB法をヒントに、高感度質量分析法とDNAバーコーディングを組み合わせたGATTAI法を独自に開発した。さらに、Hoge1の標的候補遺伝子を一部明らかにしているだけでなく、Hoge1がリン酸化されている可能性があることを見出している。こうした、Hoge1を扱うための基本的な知見の先進性は、申請者がHoge1の転写標的を同定することを可能にし、世界に先駆けるものである。

本研究で開発したGATTAI法の要素技術は、当該研究のみならず、AAA・BBB・CCCなど幅広い分野で適応可能である。そのため、本研究成果はHoge1研究のみならず、高感度を必要とするChIPのスタンダード技術として評価されている。さらに、申請者はBBBを扱うことのできる新しいシミュレーション手法も開発しており、最優秀ポスター賞を受賞した。こうした、積極的に新しい技術を開発し、これまで解決が難しかった問題に挑戦する研究アプローチは、本研究の大きな特色である。